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植酸酶生化特性研究進展
植酸是谷物、豆類、油籽和堅果中磷的主要貯存形式，其含量在1～5%左右。動物飼料中總磷的1/3是可消化的無機磷，其余的2/3則以有機磷的形式存在。單胃動物（如豬、禽）由于其胃腸道內(nèi)不分泌或只分泌很少量的降解植酸的酶――植酸酶，故不能消化利用植酸磷。植酸酶的研究和生產(chǎn)為單胃動物充分利用飼料中的磷資源開辟了新的途徑，顯著降低了飼料成本，同時大大減少了畜禽糞便對生態(tài)環(huán)境造成的磷污染。近年來，隨著植酸酶研究的不斷深入和分子生物技術的迅猛發(fā)展，人們對植酸酶生化特性的認識也越來越深刻。鑒于此，本文對植酸酶生化特性的最新研究進展進行了綜述。
1. 植酸酶的分類
生物化學命名聯(lián)合會（JCBN）列出了兩類植酸酶：即肌醇六磷酸－3－磷酸水解酶（EC 3.1.3.8）和肌醇六磷酸－6－磷酸水解酶（EC 3.1.3.26）。在近期的撰文中，Mullaney和Ullah按照結(jié)構和催化特性把植酸酶分為三類，包括組氨酸酸性磷酸酶（HAPs）、β－螺旋植酸酶（BPP）和紫色酸性磷酸酶（PAP）。
2. 植酸酶的生化特性
植酸酶是一種酯水解酶，不同來源的植酸酶，其分子量約為35～700 kDa，活性pH值范圍通常為4.5～6.0。
2.1 提純與特性
黑曲霉 NRRL 3135植酸酶（即phyA、phyB和最適pH為6.0的酸性磷酸酶）屬于分泌蛋白，在缺乏磷的淀粉培養(yǎng)基上，它們的分泌量相對較高。這些蛋白的提純譜表明總分泌蛋白的50%為phyA、phyB和最適pH為6.0的酸性磷酸酶。分泌的糖蛋白在5℃可穩(wěn)定保存幾個月，且缺乏固有的蛋白酶活性，這樣就容許在室溫下利用離子交換層析和層析聚焦法對其進行純化。由于它們的糖基化不同，因此這些蛋白被證明是微生物異源蛋白。phyA，phyB和最適pH為6.0的酸性磷酸酶單體的分子量分別約為85、65和85 kDa。通過分析真菌植酸酶對肌醇6-，5-，4-，3-磷酸的Kcat/Km值，發(fā)現(xiàn)肌醇六磷酸是phyA和phyB的最適底物，因此將它們歸為植酸酶。Casey和Walsh通過離子交換、凝膠過濾和層析聚焦提純并鑒定了來自黑曲霉 ATCC 9142的植酸酶，它是一種耐熱的胞外酶，該酶的 最適溫度為65℃，最適pH為5.0，具有較寬的底物特異性，與市場上的植酸酶相比，在80℃表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性。
Kerovuo等提純了來自枯草芽胞桿菌 VTT E-68013的植酸酶(phyC)，其最適溫度為55℃，最適pH為7.0。提純后的酶是一種金屬離子依賴性酶，因為其穩(wěn)定性和活性的發(fā)揮均需鈣離子的參與。Kerovuo等也研究了枯草芽胞桿菌植酸酶的金屬離子需要，發(fā)現(xiàn)用EDTA去除金屬離子后酶完全失活，再用鈣孵育后可部分復活。通過圓二色法推測，酶失活的原因可能是分子構象發(fā)生了變化。Golovan等提純了來自大腸桿菌的植酸酶，分子量為45 kDa，利用層析聚焦法將其進一步分為同樣大小的兩種異構體，等電點分別為6.5和6.3。異構體表現(xiàn)出相似的最適溫度和pH，即60℃和pH 4.5。Stahl等把大腸桿菌appA基因克隆到紫青紫鏈霉菌中，并將其與在巴斯德畢赤酵母中表達的基因相比，他們發(fā)現(xiàn)非糖基化植酸酶的耐熱性在45和55℃，比糖基化的植酸酶高，但在65和75℃又分別低80%和94%。
Tambe等從來自產(chǎn)氣克雷伯氏菌的植酸酶中分離出兩種異構體，它們的分子量、等電點、Km、熱穩(wěn)定性、最適pH和溫度均不相同。據(jù)報道這是第一例保留了全部植酸酶活性的分子量僅為10～13 kDa的小片段植酸酶。Segueilha等用柱層析法從卡斯許旺酵母產(chǎn)生的植酸酶中提純了一種490 kDa的四聚體植酸酶(大亞基為125 kDa，其它三個相同的小亞基為70 kDa)，此酶的最適溫度為77℃，最適pH為4.4，能使植酸鹽完全脫磷。來自丁香假單胞菌MOK1的植酸酶（EC 3.1.3.8）用陰陽離子交換層析法提純后，在40℃和pH 5.5表現(xiàn)出最大活性和較強的底物特異性。Kim等對來自布氏檸檬酸桿菌的胞內(nèi)植酸酶進行了12,800倍的純化，使其達到同質(zhì)化，其活性為3457 U/mg，這比以前報道的大腸桿菌植酸酶的活性高1.9倍。
總的說來，植酸酶在50～70℃表現(xiàn)出較高的活性，其最適溫度多在45～60℃之間。
2.1.1 催化特性
當植酸酶完全降解植酸后最終釋放出肌醇和正磷酸，其中間產(chǎn)物有單-，2-，3-，4-和5-肌醇酯。因此，植酸酶的活性測定可通過檢測正磷酸或低級肌醇磷酸鹽的量來進行。通常用比色法測定無機磷，其要從無機溶劑中提取生成的磷鉬酸鹽。最近，反相C18 HPLC法被用來進行植酸或低級肌醇磷酸鹽的分離和定量測定。植酸酶的活性單位被定義為每秒每毫升釋放出的磷的納摩爾數(shù)（nkat/s）。在檢測條件下，植酸酶對植酸具有很高的特異性，利用這一特性可以將其與酸性磷酸酶區(qū)分開來，因酸性磷酸酶是不能降解植酸鹽的。為了研究植酸酶氨基酸序列的自然變異以及它們對其催化活性的影響，Brugger等克隆并超量表達了來自六個新煙曲霉隔離種群的植酸酶基因。在所有蛋白中，來自煙曲霉變體的植酸酶更具變異性（86％的氨基酸序列同源性），其比活更高，并具有明顯不同的催化特征。
2.1.2 動力學和底物選擇
對植酸鹽脫磷酸的動力學參數(shù)已進行了廣泛的研究。植酸的米氏常數(shù)（Km）在17 μM（香蒲植酸酶）到91μM（玉米植酸酶）范圍內(nèi)變化，無花果曲霉植酸酶的米氏常數(shù)為40 μM。盡管植酸酶對植酸是相當特異的，但其底物特異性會因分子特征不同而有所變化。一般情況下，酶的水解率符合經(jīng)典米－曼氏動力學，即磷的釋放依賴于底物濃度。通常情況下都認為無機磷酸鹽會抑制植酸鹽的水解（競爭性抑制），而在特定條件下，當植酸鹽濃度高于1.2 mM時會發(fā)生底物抑制。Ullah和Sethumadhavan對無花果曲霉和枸杞孢伏革菌 (PL)的植酸酶phyA進行了提純和定性研究，發(fā)現(xiàn)二聚體PL植酸酶比AF植酸酶短26個殘基，AF植酸酶是一種單體蛋白。雖然在58 ℃和pH 5.0條件下，PL植酸酶（22,000 nkat/mg）比AF植酸酶（3000 nkat/mg）表現(xiàn)出更高的比活性，但AF植酸酶比PL植酸酶的耐熱性好（65 ℃）。盡管兩者的活性位點相似，但其轉(zhuǎn)換數(shù)、最適pH及在高溫和堿性條件下的穩(wěn)定性卻明顯不同，這表明它們適于在不同的環(huán)境下對植酸酶進行降解，這是由不同的進化歷程導致的。
2.1.3 低級肌醇六磷酸鹽異構體的探測
對肌醇磷酸鹽進行有效分析是很困難的，因為它們不吸收可見光和紫外光，也不能用特定的比色試劑進行識別鑒定。通常用氯化鐵作沉淀劑來測定這些化合物，然而，這種方法是不充分的，并且缺乏鑒別各種異構體所需的特異性。隨著離子偶HPLC方法的發(fā)展，才使對肌醇六磷酸鹽水解產(chǎn)物的研究成為可能，但這些方法也不能區(qū)分肌醇磷酸鹽的各種異構體形式，因為梯度洗脫不能進行RI的探測。Mayr針對聚陰離子發(fā)展了一種新的以染料絡合和過渡金屬為基礎的后柱探測系統(tǒng)，稱作“金屬－染料探測”，這種方法可在皮摩爾數(shù)量級上對多磷酸非放射性化合物進行異構體選擇性測定。同時各種各樣的肌醇磷酸鹽（包括所有的四個五磷酸鹽和四個四磷酸鹽）可用梯度離子層析結(jié)合后柱衍生法進行確定。據(jù)報道，有人通過帶有RI探測器的反相C18柱HPLC法檢測了肌醇和肌醇磷酸鹽。然而遺留問題是如何從各種肌醇磷酸鹽（IP1－IP6）中分離出各種異構體。Skoglund等發(fā)展了一種靈敏的高性能離子色譜法（HPIC）用于各種異構體（IP1－IP6）的分離和定量測定，該方法利用了帶有梯度洗脫的高性能離子交換柱，通過后柱反應或化學抑制電導法進行探測。
2.2 固定化研究
植酸酶按順序作用于肌醇六磷酸鹽釋放出各種低級異構體。因此，一個有效的固定化生物反應器不但能釋放金屬離子和蛋白等，還可產(chǎn)生各種植酸異構體。Quan等將克魯斯假絲酵母細胞固定在海藻酸鈣膠粒中來制備各種肌醇磷酸鹽，并用離子交換色譜將純異構體分離出來，通過NMR（核磁共振）分析，除了肌醇五磷酸之外，他們得到了其它各種肌醇磷酸的單一異構體。Gautam等以無花果曲霉和少孢根霉為發(fā)酵菌種，利用聚苯乙烯作惰性固體載體，在pH 6.0、30 ℃和水分58.3％的條件下進行固體發(fā)酵產(chǎn)出胞外植酸酶。Ullah和Cummins通過將黑曲霉 NRRL 3135 phyA植酸酶共價固定在Fractogel TSK HW-75F上構建了一種填充床生物反應器。盡管最適pH未見發(fā)生變化，但最適溫度卻由58℃升至65℃ ，對植酸鹽的Km值也升高了，并使磷的釋放高出50%。在生物反應器中使植酸鹽反復水解之后，用HPLC對產(chǎn)品進行分析，在洗出液中僅探測到了肌醇磷酸和肌醇二磷酸。據(jù)觀察，當通過蛋白質(zhì)主鏈對植酸酶進行固定化時，植酸酶的活性和生物反應器的產(chǎn)量都有所降低。這可能由于在酶與蛋白基質(zhì)進行廣泛交聯(lián)時植酸酶活性中心發(fā)生扭曲的緣故。由于天然植酸酶已被嚴重糖基化，所以阻止廣泛交聯(lián)是困難的。通過位點直接突變，有可能去除糖基化的殘基，從而產(chǎn)生的植酸酶能被部分碳水化合物固定并保持高活性。Greiner和Konietzny通過將大腸桿菌植酸酶共價固定在NHS活化Sepharose 上，提高了其耐熱性。Liu等把無花果曲霉植酸酶的最適溫度提高到58℃，比自由狀態(tài)的植酸酶高8℃，這是通過將酶固定在明膠中并用甲醛硬化實現(xiàn)的，其表觀Km提高到3.28 mM（自由酶：Km＝2.34 mM），酶的剩余活性僅為34.6%。
2.3 植酸酶工程研究
熱穩(wěn)定性酶的工業(yè)重要性正日益提高，因此，除了研究酶的熱穩(wěn)定性之外，酶的分離、定性和酶工程也都成了當前研究的熱點。熱穩(wěn)定性是酶成功應用于動物飼料中的先決條件，因為要經(jīng)受60～90℃的制粒過程。故旨在提高植酸酶在各種條件下催化活性的酶工程設計將產(chǎn)生巨大效益。Tomschy等通過合理誘變改變了植酸酶（煙曲霉和共有序列植酸酶）的pH活性曲線，使之更適合于植酸酶在動物飼料工業(yè)中的應用。Lehmann等利用一種新奇的共有序列方法提高了真菌植酸酶的固有耐熱性，經(jīng)過對來自六種不同真菌的13種植酸酶進行序列比較研究以及對每個殘基的最保守位置進行選擇，重新構建了共有序列植酸酶，其熱穩(wěn)定性得到了提高。之后，他們又納入了另外六個植酸酶序列的共有氨基酸序列，并通過位點直接誘變研究了38種氨基酸的取代作用。在共有植酸酶序列中引入穩(wěn)定化的氨基酸提高了植酸酶－1和植酸酶－10的伸展溫度，這一做法證明利用共有序列概念對蛋白質(zhì)進行改造來提高其熱穩(wěn)定性是有效的。
3. 展望
雖然報道了相當數(shù)量的可產(chǎn)生植酸酶的微生物，但應看到，對具有寬泛底物特異性和高比活的熱穩(wěn)定及酸穩(wěn)定的植酸酶仍然是非常期待的，這種植酸酶應用于動物營養(yǎng)領域?qū)⒕哂芯薮蟮纳虡I(yè)價值。
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