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甲醇營養型巴斯德畢赤酵母的認識
酵母是單細胞真核微生物，其遺傳操作簡單，對翻譯后的蛋白質有加工修飾的能力，因此在生物技術表達外源蛋白方面是一個很有吸引力的表達系統。與原核表達系統如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等相比，酵母有先進的外源蛋白折疊系統、較強的分泌能力和后加工能力；與動物細胞表達系統相比，酵母可以在簡單的合成培養基中生長，并且生長速率快、成本低。酵母表達系統中主要有常規的釀酒酵母和非常規的酵母，后者主要有以甲醇為唯一碳源能源的甲醇營養型酵母和能以乳糖為唯一碳源能源的乳酸克魯維酵母。我們公司用于發酵生產植酸酶的菌株就是屬于甲醇營養型酵母的巴斯德畢赤酵母，該酵母在近年的研究中表現出很廣泛的應用前景。
巴斯德畢赤酵母的生物學特點
畢赤酵母屬的細胞呈短橢圓行或圓柱形，多邊芽殖，有些種形成假菌絲，有性繁殖時會形成子囊孢子。巴斯德畢赤酵母是一種可以在以甲醇為唯一碳源和能源的培養基中生長的酵母菌，因為其細胞中的過氧化物酶體中含有甲醇代謝途徑的必需酶，如醇氧化酶、二羥丙酮合成酶和過氧化氫酶等，其中醇氧化酶（AOX）是甲醇利用途徑中的第一個酶，該酶受到葡萄糖、甘油和乙醇等碳源的阻遏。
甲醇營養型畢赤酵母在以甲醇為唯一碳源生長時，首先甲醇在醇氧化酶的作用下被氧化成甲醛和過氧化氫，然后甲醛被氧化成甲酸，并生成二氧化碳，過氧化氫則在過氧化氫酶的作用下變成水和氧氣；另外，生成的甲醛還可以通過木酮糖單磷酸途徑被同化成磷酸二羥丙酮和磷酸甘油醛。這兩種代謝途徑都能為細胞生長提供能量和細胞結構物質。
甲醇營養型畢赤酵母的優勢
甲醇營養型畢赤酵母與重組釀酒酵母比較具有以下優勢：
(1)具有精確調控的啟動子，可以精確表達目的外源蛋白；
(2)表達效率高，其表達的外源蛋白可占總表達蛋白的90％以上，有利于目的蛋白的分離純化；
(3)在簡單合成培養基中可實現高密度培養；
(4)由于該酵母可以以甲醇為唯一的碳源和能源，而絕大多數微生物并不能以甲醇為碳源，這樣就可以極大程度地降低雜菌在發酵液中的繁殖量，減小其對正常發酵的不利影響。因此，甲醇營養型畢赤酵母是近年來作為表達外源目的蛋白最有前途的表達系統。
外源蛋白在甲醇營養型畢赤酵母中的表達
畢赤酵母發酵生產外源蛋白的過程一般包括3個階段：(1)細胞增殖階段，細胞在含有易利用碳源（如葡萄糖、甘油等）的培養基中快速繁殖以積累生物量；(2)分批流加的過渡階段，在此階段中向培養基中限制性流加葡萄糖、甘油等碳源，進一步積累細胞量，為誘導表達做準備；(3)誘導表達階段，以限制性速率流加甲醇或甲醇與葡萄糖、甘油等的混合液，誘導表達外源目的蛋白。各階段碳源都為限制性基質，其補加速率的動力學模型是高效表達的基礎。
應用前景及局限性
巴斯德畢赤酵母表達系統的諸多優勢使之越來越受到關注，其研究價值和商業價值亦不斷體現。在載體構建和新型菌株的開發方面，已經取得了卓有成效的研究成果。但是作為一種新的表達系統，畢赤酵母也存在一些不足之處，如發酵周期長；利用易燃易爆有毒的甲醇做原料，生產過程和表達產物的衛生安全性需要考慮；篩選高產菌株需用的藥物價格比較昂貴，也給生產應用帶來局限；另外，表達過程的控制和培養基配方等尚有待于進一步開展開創性的探索研究，突破傳統培養發酵模式，優化培養基配方，為提高外源蛋白的表達量作出積極有益的探索。因此還需要對此表達系統做更深入的研究，相信隨著對甲醇營養型酵母表達機制的進一步了解，在不久的將來它必將在分子生物學以及工業發酵的各個領域發揮更大的作用。
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